高效液相色谱法原理 高效液相色谱仪的使用和原理
浩宇养生高效液相色谱法是分离、分析和纯化有机化合物的有效方法之一。大约80%的已知有机化合物可以通过高效液相色谱分离和分析。由于该方法条件温和，不损伤样品，特别适用于沸点高、不易气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生物物质。
HPLC系统一般由输液泵、注射器、色谱柱、检测器、数据记录和处理装置等组成。输液泵、色谱柱和检测器是关键部件。一些仪器包括梯度洗脱装置、在线脱气器、自动取样器、色谱柱或保护装置、色谱柱温度控制器等。现代高效液相色谱仪还具有微机控制系统，用于仪器自动控制和数据处理。制备型高效液相色谱仪还配有自动馏分收集装置。
目前常见的高效液相色谱仪生产厂家有国外的沃特世公司、安捷伦公司、岛津公司，以及上海五峰科学仪器有限公司、上海何工科学仪器有限公司、大连易园俊苏公司、北京创新通恒、北京文芬等。
一、输液泵
1.泵的结构和性能输液泵是高效液相色谱系统中最重要的部件之一。泵的性能直接影响分析结果的整体质量和可靠性。输液泵应具有以下性能:
①流速稳定，其RSD应小于0.5%，关系到定性定量的准确性；
②流量范围宽，分析型应在0.1 ~ 10 ml/min范围内连续调节，配制型应达到100ml/min；
③输出压力高，一般应达到150 ~ 300kg/cm2；
④液压缸体积小；
⑤密封性能好，耐腐蚀。
泵的种类很多，根据输液的性质可以分为恒压泵和恒流泵。恒流量泵可分为螺旋喷射泵、柱塞往复泵和往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺杆泵的缸体太大，所以这两个泵都被淘汰了。柱塞往复泵是目前应用最广泛的泵。
柱塞式往复泵的缸体容积小，可达0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适用于再循环和梯度洗脱改变电机转速可轻松调节流量，且流量不受柱压影响；泵压可达400公斤/平方厘米。ADW的主要缺点是输出脉冲较大，这被双泵系统所克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式。一般来说，并联泵的流量重现性较好，但出现故障的几率较大，价格也较贵。
第二，采样器
高效液相色谱分析一般采用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫和固定底座组成。耐压高，进样量准确，重复性好，操作方便。六通阀的取样方法有两种:部分充注法和完全充注法。采用部分充液法取样时，取样量应不超过回路容积的50%，每次取样的容积应准确、一致。该方法进样的准确性和重复性取决于进样器采样的熟练程度，容易因进样而产生峰展宽。采用完全充液法进样时，进样体积应不小于回路体积的5 ~ 10倍，且至少为3倍，以完全替代回路和流动相，消除管壁效应，保证进样的准确性和重复性。
第三，色谱柱
色谱是分离分析的手段，分离是核心，所以负责分离的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快。各种市售高效液相色谱颗粒填料包括多孔硅胶、基于硅胶的粘结相、氧化铝、有机聚合物微球、多孔碳等。粒度一般为3、5、7、10 μm等。理论柱效可达50000-160000/m..对于一般分析，柱效只需要5000个塔板；对于同系物分析，只要500；对于难分离的对，最多可使用20000根色谱柱，因此10 ~ 30 cm左右的色谱柱长度可以满足复杂混合物分析的需要。
柱效率受柱内外因素的影响。为了达到塔的最佳效率，塔外死体积应小，不宜采用合理的塔结构和填料技术。即使采用最好的填充技术，柱中心的填充情况始终与沿管壁的填充情况不同，靠近管壁的部分比较松散，容易产生窜流，流速快，影响冲洗剂的歧管，使光谱带变宽，这就是管壁效应。该管壁面积大约是从管壁向内的材料直径厚度的30倍。在一般液相色谱系统中，柱外效应对柱效率的影响远大于管壁效应。
四.探测器
高效液相色谱检测器有两种类型:通用检测器和专用检测器。
1.通用检测器可以连续测量色谱柱流出物的所有特征变化，通常采用微分测量法，包括微分折射率检测器、介电常数检测器、电导率检测器等。通用检测器的应用范围很广，但由于它对流动相有响应，容易受到温度变化、流动相和组分变化、噪声和漂移较大的影响，灵敏度较低，因此不能通过梯度洗脱。
2.专用检测器用于测量分离样品成分的某些特性的变化。这种检测器对样品中成分的某些物理或化学性质敏感，这些性质是流动相所不具备的，或者至少在操作条件下不会显示出来。这类探测器包括紫外探测器、荧光探测器、放射性探测器等。
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