"基因合成" DNA的生物合成

基本要求:

1.掌握与DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录相关的基本概念。包括半保守复制、半不连续复制、复制叉、复制子、冈崎片段、前导链、跟随链、端粒、端粒酶等。

2.掌握复制过程及复制过程中涉及的各种酶和蛋白因子；并掌握原核生物和真核生物的异同。

3.掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。

4.了解地中海贫血和镰状细胞贫血的分子机制。

重点:生物体内合成DNA分子有三种方式:DNA引导的DNA合成，也叫复制，是细胞内合成DNA最重要的方式。遗传信息储存在DNA分子中。当细胞增殖时，DNA复制将遗传信息从父母传递给后代。修复合成，即损伤后的DNA修复，需要局部的DNA合成来保证遗传信息的稳定遗传。RNA导向的DNA合成，即逆转录合成，是RNA病毒的一种复制形式，它以RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成DNA。真核生物的DNA合成过程与原核生物基本相似，但机制仍不清楚。以原核生物的复制过程为例进行介绍。

难点:DNA的双螺旋结构是复制的结构基础。DNA复制的本质是酶催化脱氧核苷酸的聚合。复制开始时，将亲本双链DNA分子解开，分别作为模板。在依赖于DNA的DNA聚合酶的催化下，四个脱氧核苷酸按照碱基配对的原理连接成DNA大分子。合成产物的碱基序列与模板DNA的碱基序列互补。在后代DNA双链分子中，一个来自母体模板链，另一个是新合成的链，因此被称为半保守复制，这是生物体中最重要的DNA合成方式。在合成过程中，一条前导链是从5’→3’连续合成的，一些片段是不连续合成的，然后连接成一条跟随链，所以DNA合成是半不连续合成。反应过程很复杂。首先是螺旋松弛，双链打开形成复制叉，然后开始复制，包括合成引物形成引发剂，最后是DNA链的延伸和终止。每个阶段都需要涉及到很多酶和蛋白质因子，包括拓扑异构酶，用来理顺由解链过程引起的链的缠绕和打结；在蛋白质因子的帮助下，解旋酶与复制起点结合，打开双链，由单链结合蛋白稳定解链；引物酶和其他辅助蛋白因子催化开放双链上引物的合成，提供3’-羟基并与dNTP的5’-P形成磷酸二酯键。然后DNA聚合酶催化聚合反应，而DNA连接酶将复制中不连续的片段连接成一条完整的链。与原核生物相比，真核生物的复制具有多起点、五种DNA聚合酶和端粒复制的特点。

1.DNA复制

基本要求:

1.掌握复制叉、半不连续复制、冈崎片段、前导链和跟随链的基本概念。

2.掌握拓扑异构酶、解旋酶、单链结合蛋白、引物酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的特性和生物学功能。

3.熟悉DNA的合成过程。

4.理解半保守复制的实验基础。

基本概念:

1.中心法则:遗传信息通过转录从DNA流向RNA，RNA在翻译的指导下合成蛋白质。这种遗传信息的传递规律叫做。少数RNA也是遗传信息的储存库，而RNA可以反转录成DNA，这是对中心法则的补充。

2.复制:即DNA生物合成，以DNA为模板，指导合成相同的DNA分子，使遗传信息从父母传给后代。核糖核酸病毒的遗传信息储存在核糖核酸分子中，核糖核酸分子可以复制核糖核酸，反向转录脱氧核糖核酸。

3.半保守复制:在DNA复制过程中，将母体DNA的双螺旋结构解开，以两条解开的单链为模板，以dNTP为原料。根据碱基互补原理，合成了一条与模板链互补的新链，从而形成两条子代DNA双链，其结构与亲本DNA双链完全一致。因子生成DNA双链的一条单链来源于亲本，另一条单链是新的合成链。形成的双链的碱基序列与亲本双链的碱基序列完全一致，因此称为半保守复制。

4.复制叉:原核生物DNA复制从单一起点开始，双螺旋结构被打开，两条独立的单链被用作新DNA合成的模板。DNA合成从起点向两个方向进行，与单个起点相连的局部结构为Y形，称为复制叉结构。

5.半不连续复制:在复制过程中，催化DNA合成的DNA聚合酶只能催化5'→3 '方向的核苷酸合成，当以3'→ 5 '链为模板时，新生DNA在5'→3 '方向连续合成。但以5’→3’为模板，只能合成少数反向互补的冈崎片段，这些片段相互连接形成一条完整的新链，故称之为半不连续复制。

6.冈崎片段:DNA双链反平行。在复制过程中，父双链DNA在复制分叉处打开。因为新链的合成是有方向性的，即从5’→3’开始，以5’→3’DNA链为模板合成反向互补的新链时，只能合成DNA的小片段。根据发现者的说法，这些碎片被命名为冈崎碎片。

7.前导链和跟随链:DNA双链是反向的。复制时，两条链都作为模板，但新链的合成只能是5’→3’。因此，沿着熔化方向合成的子链的复制是连续的。这条链称为前导链，而另一条新链的复制方向与熔解方向相反，复制不连续。这种不连续合成的链称为从动链。

8.引发剂:是由DnaA蛋白、DnaB蛋白、DnaC蛋白、引物酶和DNA初始复制区组成的复合结构。DnaA蛋白识别复制起点，DnaB蛋白具有解旋功能，DnaC蛋白将DnaB蛋白组装到复制起点，引物由引物酶合成。

原核生物的复制

1.复制相关酶和蛋白质:

拓扑异构酶:通过切断和连接一条或两条DNA双链来改变DNA分子的拓扑构象，避免DNA分子的打结、缠绕和互锁，在整个复制过程中发挥作用。有拓扑异构酶ⅰ和拓扑异构酶ⅱ。拓扑异构酶I可以切断DNA双链的一条链，重新连接断裂的末端，反应不需要ATP能量；拓扑异构酶II可以同时断裂和重新连接DNA双链，需要ATP能量，使DNA分子进入负超螺旋。

分解解旋酶:复制DNA时，应以双亲DNA的双链为模板，指导后代DNA分子的合成。分解解旋酶可以将DNA双链解链为单链。大肠杆菌中发现的解旋酶是脱氧核糖核酸。

单链结合蛋白:复制过程中模板应处于单链状态，SSB可以保护模板不被核酸酶降解。随着DNA双链的解链，SSB可以与它们结合和解离。

Primase是一种RNA聚合酶，在复制起点催化合成以DNA为模板的短互补RNA。DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应，没有引物也不能引发DNA合成。引物酶可以直接催化游离NTP在单链DNA模板上合成一个短RNA，这个短RNA引物提供3’-OH，被DNA聚合酶催化延长链。

脱氧核糖核酸聚合酶:它是一种依赖于脱氧核糖核酸的脱氧核糖核酸聚合酶，简称脱氧核糖核酸聚合酶。它以DNA为模板，以dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3’-OH端，合成互补的新DNA链，即5’→3’聚合活性。原核生物的聚合酶包括里坡聚合酶、polⅱ聚合酶和polⅲ聚合酶。DNA pol III在复制延伸中确实起到了催化作用。除了5'→3 '聚合活性外，还具有3'→ 5 '核酸外切酶活性和碱基选择功能，可以识别错配的碱基并将其去除，从而起到即时校对的作用。DNA pol I具有5'→3 '聚合活性，3'→ 5 '和5'→3 '核酸外切酶活性，5'→3 '核酸外切酶活性可用于去除引物和突变片段，起到切除和修复的作用。另外，klenow片段是蛋白酶体外水解的DNA pol I的大片段，具有DNA聚合酶和3’→5’核酸外切酶的活性，是分子生物学中常用的工具酶。DNA pol II在没有DNA pol I和DNA pol III的情况下工作，也具有5'→3 '和3'→ 5 '核酸外切酶活性。

DNA连接酶:DNA连接酶用于连接双链中的单链间隙，使相邻两个DNA片段的3’-OH端和5’-P端形成3’，5’磷酸二酯键。DNA连接酶是基因工程中一种重要的工具酶，用于缝合DNA复制、修复、重组和剪接中的缺口。

2.DNA合成过程:复制过程可分为起始、延伸和终止三个阶段。

复制自:

识别起点，合成引发剂:在大肠杆菌中，复制起点称为oriC，具有特定的结构，可以被DnaA蛋白识别和结合。DnaB蛋白具有旋开的功能，DnaC蛋白使DnaB蛋白与起点结合，DNA双链被部分打开，加入引物酶等蛋白形成引发剂。

单链的形成:DNA复制时，首先在拓扑异构酶的作用下改变分子的超螺旋构象，然后在融解酶的作用下双链断裂，从而可以开始DNA合成。在蛋白质因子的帮助下，解旋酶打开DNA双链，单链结合蛋白SSB以单链状态与模板链结合；拓扑异构酶阻止DNA分子打结和缠绕，在整个复制过程中发挥作用。

合成引物:引发剂中的引物催化RNA引物的合成，引物提供3’-OH基团，从而开始复制。引物由前导链和跟随链中的引物酶合成，在跟随链的复制中需要多次合成引物。

复制扩展:

复制方向:大肠杆菌等原核生物只有一个起点oriC，两个复制叉同时向两个方向复制，称为双向复制。

扩链:根据与模板链碱基配对的原理，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸进行扩链。由于DNA双链方向相反，DNA聚合酶只能催化5'→3 '的核苷酸合成。前导链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一条模板链沿5’→3’方向展开。跟随链的复制方向与熔化方向相反。复制只能在模板链展开一定长度后进行，因此跟随链的合成是不连续的，会形成几个冈崎片段。DNA聚合酶I的即时校对和DNA聚合酶III的碱基选择功能使复制具有保真度。

复制的终止:

原核生物如大肠杆菌，他的两个复制叉的交汇点就是复制的终点。前导链和跟随链中的引物被RNase消化，引物留下的空间隙被DNA聚合酶I催化，4种脱氧核糖三磷酸从5’→3’方向延伸填充。最后，DNA连接酶由ATP提供动力，ATP连接两个不连续片段的相邻5’-P和3’-OH形成连续的亚链，复制完成。

真核生物的复制:

真核细胞的生命可以定义为一个细胞周期。细胞增殖时，DNA的含量通过复制倍增，然后细胞分裂成两个子代细胞，DNA将父母的特征传递给后代。细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，DNA复制只发生在S期。与原核生物相比，真核生物的复制具有以下特点:

1.多重复制因子:真核生物中的DNA复制也是一种半保守复制。染色体线性分子的复制有多个起点，每个起点由两个反向移动的复制叉组成，进行双向复制。由起点控制的DNA复制称为复制子。

2.五种DNA聚合酶:与原核生物不同，真核细胞含有五种DNA聚合酶:α、β、γ、δ和ε。除了γ，所有的DNA聚合酶都存在于细胞核中。DNA聚合酶α和δ在复制延伸中起催化作用，其中DNA聚合酶α延伸跟随链，DNA聚合酶δ延伸前导链。DNA聚合酶β和ε在复制过程中起到校对、修复和填补空白的作用。线粒体中使用DNA聚合酶γ来复制线粒体DNA。

3.端粒复制:真核染色体线性分子的复制，前导链可以连续完整复制，但去除跟随链3’端引物后空的缺口无法填补，会导致双链子代缩短。解决办法是利用端粒酶复制染色体末端。端粒是染色体末端具有特定重复序列和蛋白质的结构。端粒酶是一种逆转录酶，由酶和含有重复序列的RNA分子组成。它以自身的RNA分子为模板，从跟随链的3’端合成端粒重复序列，从而延长跟随链，防止跟随链每次复制都缩短。

第二，DNA的修复和合成

在环境理化因素或生物因素的影响下，DNA序列会发生变化，包括碱基变化、断链、交联等。受损的DNA会通过一定的修复机制进行矫正，保证遗传信息的稳定性。

基本要求:

1.掌握DNA突变的概念和类型。

2.掌握受损DNA的修复机制。

3.了解突变的意义和导致突变的因素。

4.了解地中海贫血和镰状细胞贫血的分子机制。

基本概念:

1.突变是指DNA分子中碱基序列的改变，从而影响其表达产物的结构和功能。

2.移框突变:基因编码区碱基的插入或缺失，改变DNA分子三联体编码的阅读模式，从而改变转录翻译的氨基酸序列，称为移框突变。3或3n个碱基的插入或缺失不一定引起移码突变。

3.切除修复:是最重要的修复方法，涉及UvrA、UvrB、UvrC、DNA-pol I、dNTP和连接酶。首先，UvrA和UvrB识别受损部位并与之结合。UvrC切除受损的DNA。DNA-pol I以dNTP为原料，填补了切除空的空白。最后，连接酶连接缺口完成修复。

突变类型:

1.点突变:也称为错配。DNA分子中一个碱基的变异，包括转化和颠换。

2.缺失:脱氧核糖核酸分子中核苷酸或核苷酸片段的消失。

3.插入:一个核苷酸或一段核苷酸被插入到一个脱氧核糖核酸分子中。

4.重排:DNA链的内部重组，其中一个方向相反的片段或一大段链在DNA分子内迁移。

修复方法:

1.直接修复:也称光修复，利用光修复酶修复紫外线照射引起的嘧啶二聚体，使其减少。

2.切除和修复:见上文。

3.重组修复:当受损的DNA在修复前已经被复制时，复制的后代DNA会出现缺口，此时需要重建生成的后代DNA。重组蛋白RecA具有核酸酶活性，将健康母链中的缺口对应的DNA片段重组到子链中的缺口，健康母链中的缺口可以根据健康模板通过DNA聚合酶催化填充，然后通过连接酶连接，最终健康链完全恢复。

4.SOS修复:是细胞在DNA受损，难以复制时采用的应急修复方法。DNA损伤严重，诱发一系列复杂反应，产生SOS修复酶系统，包括重组蛋白、调节蛋白和用于复制修复的酶系统。

第三，反转录合成DNA

反转录，也叫反转录，是指遗传信息从RNA到DNA的流动。它是一个在RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四个dNTP为原料，合成一个与RNA互补的DNA单链。催化这一过程的酶被称为逆转录酶，它包含在核糖核酸病毒中。

1.逆转录酶:RNA导向的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA导向的DNA聚合酶、RNase和DNA导向的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为一种重要的工具酶，它被广泛用于构建基因库和获取目标基因。

2.合成过程；以RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成与RNA互补的DNA单链，形成杂交双链。逆转录酶水解RNA链，再以互补DNA链为模板合成双链DNA。

3.反转录方向:5'→3 '。