酶免 酶免技术的酶和酶作用的底物
贾老师说养生辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶常用于酶免疫分析。不同的酶有不同的底物。
1.辣根过氧化物酶:辣根过氧化物酶在蔬菜作物的辣根中含量较高，其纯化方法并不复杂。它是一种糖蛋白，糖含量约为18%。分子量为44kD；它是一种复合酶，是由主酶和辅基结合而成的卟啉蛋白。主要酶为无色糖蛋白，在275nm波长处吸收峰最高。辅助基团为深棕色含铁卟啉环，
在403纳米波长处具有最高吸收峰。辣根过氧化物酶对氢受体有很高的特异性，除H202外，只作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂比H202更方便。
许多化合物可用作辣根过氧化物酶的氧供体。酶联免疫吸附试验中常用的供氢底物是邻苯二胺、四甲基联苯胺和ABTS。OPD是酶联免疫吸附试验中应用最广泛的底物，具有灵敏度高、比色方便等优点。其缺点是制成应用溶液后稳定性差，变性差。TMB没有这样的劣势。酶作用后TMB由无色变为蓝色，视觉对比鲜明。加酸使酶反应停止，变成黄色，可用比色计定量；因此，应用程序日益增多。ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB，但是空的白值很低。
2.碱性磷酸酶提取自牛肠粘膜或大肠杆菌。从大肠杆菌中提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0。小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。对硝基苯磷酸酯一般用作底物。可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色对硝基苯酚，吸收峰在405nm。用氢氧化钠终止酶反应后，黄色在一段时间内保持稳定。
在ELISA中，AP系统的灵敏度普遍高于HRP系统，并且空的白值也较低。但由于AP难以获得高纯度的制剂，稳定性低于HRP，价格高于HRP，酶偶联物制剂的收率低于HRP，国内ELISA普遍采用HRP。
3.其他酶类:葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶。β-半乳糖苷酶的底物通常是4-甲基伞-β-半乳糖苷，经酶水解产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大大大提高了方法的灵敏度。AP也可以使用荧光伞状磷酸盐作为底物。其缺点是需要荧光计测量，如果直接用固体载体作为测量容器，载体就不能发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液pH值的变化，可改变指示剂的颜色；此外，人体内没有内源性酶。
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